у меня на весах( ювелирные) при взвешивании капля оптихена весит 0,04гр, пользую уже пол года никаких нареканий нет,

Хочу поблагодарить девочек АРОМАВИТОЧЕК !!! за свои годы перепробовала очень много кремиков и все были ПАГАНЫЕ, как только натрапыла на ВАШ сайт сразу поменяла свою ЖИЗНЬ. Сначала подсела на масла , а затем сотворила и крем. Я И моя кожа наслаждаемся комфортом увлажнения. питания
и омоложения.
СПАСИБО ЗА ТО ЧТО ВЫ ЕСТЬ!! ОЧЕНЬ ,ОЧЕНЬ , БЛАГОДАРНА. ЕСЛИ БЫ НЕ ВЫ ТАК И УМЕРЛА БЫ В НЕВЕДЕНЬИ о великом увлажнении, питании и омоложении.

рекомендую Книжку - Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология. Децина А.Н. - там про все и о всем связано с кожей и добавками.

11.3.2. Примеры использования клеточных тест-систем при подборе биоцидных добавок к косметическим средствам
Рассмотрим попытку автора книги и сотрудников*) экспериментально оценить относительную эффективность с одновременной оценкой безопасности некоторых консервирующих систем.




--------------------------------------------------------------------------------

*) В экспериментах принимали участие Бачинский А.Г., Вязовая Е.А., Репин В.Е. и Селиванов Б.А.

При разработке составов косметических композиций "Сибирской природной косметики" авторы строго придерживаются принципа отсутствия в композициях компонентов, не встречающихся в природе. Мотивируется это тем, что на пути своего эволюционного развития каждая биологическая система (в том числе и человек) адаптируется к тем факторам среды, в окружении которых она развивается. Таким образом, практически для каждого природного химического соединения в организме человека выработаны способы его утилизации, нейтрализации и выведения. Этого нельзя сказать о массе тех соединений, которые были синтезированы и вошли в нашу жизнь за последние 50-70 лет. Вспомним хотя бы печальный опыт применения ДДТ, который был обнаружен даже в организме пингвинов Антарктики.

В качестве природных консервантов нами используются экстракты прополиса, листьев березы, черемухи и смородины, а также бензойная кислота, которая, хоть и является химически синтезированным компонентом, однако, в заметных количествах присутствует в некоторых растениях, например, в ягодах брусники и клюквы.

Ранее эффективность действия природных консервантов, использующихся в композициях "Сибирской природной косметики", определялась косвенным путем, а именно: высокопитательная композиция, содержащая то или иное количество консерванта (или комбинации консервантов), выставлял ась на хранение при комнатной температуре с периодической оценкой ее состояния по изменению цвета, запаха, консистенции и кислотности. Затем, для отобранных доз консерванта, та же процедура повторялась для хранения в условиях бытового холодильника (при 5-10°). Таким образом, были определены минимальные рабочие концентрации таких консервантов, как спиртовые экстракты прополиса, майских листьев березы и черемухи, листьев смородины. Эти концентрации составляли 5-10% в зависимости от питательной ценности композиции и "микробиологической чистоты" входящих в нее компонентов, а, возможно, и других факторов. Рабочая концентрация известного консерванта - бензоата натрия составила 0.1 0.3%. В последнее время поступили сведения о возможной бактериостатической активности таких составляющих кремовых композиций, как масляный экстракт корня воробейника краснокорневого (каллусная культура) - шиконин и сок чистотела.

Для проверки действия этих консервантов на стандартные тестовые культуры Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Candida albicans были поставлены прямые эксперименты в НИИ коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор". Тестирование проводилось в жидких культурах, продолжительность инкубации 20 часов. Титрование проводилось на твердых агаризованных средах путем подсчета выросших колоний. Каждый эксперимент делался дважды при 3-х повторностях титрования.

Консерванты использовались в следующих концентрациях:

- листья березы (спиртовая настойка), рН=7 5%

- листья черемухи (спиртовая настойка), рН=7 10%

- листья смородины (спиртовая настойка), рН=7 10%

- прополис (спиртовый раствор), рН=7 10%

- бензоат натрия (порошок), рН=7 и рН=5.5 0.3%

- чистотел (сок), рН=7 1%

- шиконин (масляный раствор), рН=7 0.5%

Результаты представлены в таблице 11.8



Таблица 11.8 Влияние консервантов на рост микробных тест-культур (средние значения в КОЕ/мл)


Для того, чтобы вычленить консервирующее действие этилового спирта, был проведен специальный эксперимент, результаты которого представлены в табл. 11.9.



Таблица 11.9 Влияние спирта на развитие микробиологических тест-культур


Из приведенных данных следует, что этиловый спирт в концентрации 10% угнетает клеточный рост на 1-2 порядка. Таким образом, наблюдаемое снижение концентрации микроорганизмов от 3 до 9 порядков для спиртовых экстрактов прополиса и листьев смородины и черёмухи не может быть объяснено только влиянием спирта. Совершенно очевидно, что в большинстве случаев наблюдаемое угнетение роста микроорганизмов (см.табл.11.8) определяется суммарным действием этилового спирта и экстрактивных веществ.

Из приведенных данных можно сделать вывод, что наиболее эффективными консервантами являются экстракты листьев черемухи и смородины. Шиконин и сок чистотела в указанных концентрациях не проявили своих консервирующих свойств. Поскольку настойка листьев березы использовалась в половинной концентрации (из-за плохой растворимости экстракта в воде), то трудно сравнивать ее эффективность с другими консервантами.

Интересные данные получены для бензоата натрия. В кислой среде (в условиях, когда бензоат натрия превращается в бензойную кислоту) его биоцидное действие оказывается достаточно высоким для всех тест-культур. Однако при рН 7,0 бензоат натрия практически не сдерживает развитие всех культур, за исключением грибковой культуры Candida albicans, рост которой блокируется даже более эффективно, чем в кислой среде. Учитывая то обстоятельство, что оптимальное значение рН для косметических препаратов находится вблизи величины 7,0, можно было рекомендовать использование добавок бензоата натрия наряду с другими биоцидными добавками для усиления фунгицидного действия консервирующей системы.

Следующим шагом было исследование влияния указанных консервантов на состояние клеток животных в культуре. Эксперименты были проведены сотрудницей Института иммунологии СО РАМН Вязовой Е.А. Тестовой культурой была очень неприхотливая культура фибробластов мыши L929.

Сформировавшийся монослой клеток обрабатывался консервантами в течение часа, затем, через 24 часа после смены среды, производился подсчет живых и мертвых клеток. При этом использовались следующие концентрации консервантов в среде культивирования.

- листья березы (спиртовая настойка) 5%

- листья черемухи (спиртовая настойка) 5%

- листья смородины (спиртовая настойка) 5%

- прополис (спиртовый раствор) 5%

- бензоат натрия (порошок) 0,15%

- метилпарабен (порошок) 0,1%

Снижение концентрации биоцидных систем в два раза потребовалось, потому что их добавление к питательным средам в тех же концентрациях, которые использовались при изучении ингибирования роста микроорганизмов, приводило практически к полному уничтожению клеток.

В этом эксперименте в качестве модельной биоцидной системы мы использовали широко применяемый метилпарабен в концентрации 0,1%.

Обработка клеток консервантами приводила к трём последствиям:

а) клетки погибали и смывались с основы при смене среды;

б) клетки погибали, но оставались на основе;

в) клетки сохранялись в жизнеспособном состоянии.

Результаты исследований приведены на рис.11.1.



Рисунок 11.1 Количество клеток в монослое по отношению к контролю (светлые столбцы) и доля мёртвых среди них (тёмные) при действии консервантов на клетки L929


Обозначения: 1 - бензоат натрия;

2 - настойка майских листьев черемухи;

3 - настойка листьев смородины;

4 - настойка майских листьев березы;

5 - спиртовый экстракт прополиса;

6 - метилпарабен.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее щадящим действием в отношении клеточных тканевых культур обладают бензоат натрия, спиртовый экстракт листьев черемухи и смородины. И абсолютно отрицательное действие на клеточную культуру L929 проявляет метилпарабен.

Эти выводы хорошо укладывались в разрабатываемую нами концепцию, в соответствии с которой консерванты природного происхождения более предпочтительны по сравнению с химически синтезированным веществами, не встречающимися в природе. А так как в литературе нам не встречались сведения о природном происхождении n-оксибензойной кислоты и её эфиров (в отличие от о-оксибензойной (салициловой) кислоты), то неблагоприятное влияние метилпарабена на клеточную систему казалось вполне обоснованным.

Представляя всю ответственность за интерпретацию полученных результатов и учитывая сложности, связанные со стандартизацией методики работы с клеточными культурами, был проведен дополнительный эксперимент, в ходе которого проводилась оценка не только тех клеток, которые оставались на планшете после одночасовой обработки питательными средами, содержащими биоцидные добавки, а также после последующего 24-часового подращивания, но и клеток, которые смывались с планшета. Фактически мы попытались зафиксировать брутто-характеристики процесса взаимодействия клеток L929 с опытными питательными средами. Кроме этого, нас интересовала динамика поведения клеточной системы в зависимости от времени и возможное влияние спирта, добавляемого в опытные питательные среды в количестве около 5% при внесении биоцидных экстрактов. В этом эксперименте мы ограничивались биоцидными добавками, проявившими промежуточную биоцидную активность (экстракты листьев смородины и березы, а также экстракт прополиса). В процессе расчета относительной доли живых и мертвых клеток суммировались значения, полученные в результате определения количества живых и мертвых клеток в "смыве" (после удаления среды), и количества клеток, остающихся прикрепленными к поверхности стекла. Результаты экспериментов, представленных на рис. 11.2, свидетельствуют о том, что, в отличие от первого исследования (см.рис.11.1), произошла некоторая "реабилитация" экстракта листьев березы. Для экстракта листьев смородины результаты практически совпали с результатами первого исследования. Обращает также на себя внимание, что количество жизнеспособных клеток, определенных непосредственно после одночасового воздействия биоцидных систем, в результате последующего выдерживания в ростовой среде дополнительно снижается. Такой же своеобразный отрицательный "эффект последействия" наблюдается и для мертвых клеток, что может объясняться их разрушением (лизисом) в процессе 24-часового выдерживания в ростовой среде. И только в случае добавки чистого этанола для живых клеток мы наблюдаем "положительный эффект последействия". Это обстоятельство, вне всякого сомнения, может свидетельствовать о различиях в механизмах действия этилового спирта и экстрактивных веществ из листьев смородины, березы и прополиса.



Рисунок 11.2 Количество живых клеток по отношению к контролю (светлые столбцы) и количество мертвых (темные столбцы) при действии биоцидных добавок на клетки L929 в течение часа и последующего выдерживания в нормальной среде в течение 24 часов


Ранее нами было показано, что механизм действия этилового спирта на клетки ЛЭЧ, по-видимому, связан с осмотическим воздействием. При этом, после 72-часовой обработки клеточной системы питательной средой, содержащей добавку этилового спирта, повышающую осмолярность среды на 200 мОсм (суммарно со средой примерно 500 мОсм), клеточная система разрушается практически полностью. Теперь мы можем сказать, что обработка клеток L929 в течение одного часа питательной средой (осмоляльность примерно 300 мОсм), содержащей 5% этилового спирта (осмоляльность примерно 1045 мОсм) и обладающей суммарной осмоляльностью примерно 1345 мОсм, ингибирует клеточный рост примерно на 46%, а после 24 часов выдерживания этих клеток в нормальной ростовой среде количество клеток возрастает от 54 до 71%. Это хорошо согласуется с механизмом осмотического воздействия: имеется в среде осмотическая активная добавка - наблюдается торможение клеточного роста, который стремится к восстановлению после удаления добавки (положительный эффект последействия).

Совершенно иная ситуация возникает при воздействии на клетки экстрактивных веществ из листьев смородины, березы и из прополиса. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что воздействие такого рода добавок на клеточную систему приводит к существенным нарушениям, которые сохраняются и продолжают усиливаться даже после замены опытной среды (с добавкой) на нормальную ростовую питательную среду (отрицательный эффект последействия).

Рассматривая полученные результаты применительно к косметическим воздействиям, можно предположить, что в отличие от осмотических воздействий на базальные клетки эпидермиса, которые легко устраняются за счет принудительного омывания клеток межклеточной жидкостью, воздействия добавок, проявляющих отрицательный эффект последействия, может оказаться весьма драматичным. Ведь в данном случае базальные клетки практически лишаются одного из очень важных механизмов защиты, связанного с циркуляцией межклеточной жидкости. В этом и заключается опасность использования в косметических препаратах ингредиентов, обладающих отрицательным эффектом последействия.

В принципе, казалось, что полученных нами данных достаточно для того, чтобы рекомендовать разработанную методику, учитывающую как относительные величины доли живых клеток по сравнению с контролем, так и динамику эффекта последействия. Однако наша попытка воспроизвести эту методику другой группой исследователей*) привела к неожиданному результату.




--------------------------------------------------------------------------------

*) Исследования проводились сотрудниками ГНЦ ВБ "Вектор" Колокольцовой Т.Д. и Шумаковой О.В.

В отличие от предыдущих экспериментов в данном случае применялась другая питательная среда (Игла МЕМ, вместо DМЕМ), другой тип сыворотки (сыворотка крупного рогатого скота вместо сыворотки новорожденного теленка). Культуральщики знают о том, что такие изменения в условиях эксперимента могут драматически отразиться на результатах, так как среда DМЕМ обладает большей питательной ценностью, а сыворотка КРС проигрывает фетальной сыворотке по ростстимулирующему действию. В целом, условия этого эксперимента были более жесткими по отношению к используемой клеточной культуре, источник получения которой также отличался от предыдущих экспериментов.

Проверке были подвергнуты экстракты листьев черемухи, смородины и березы, а также бензоат натрия, метилпарабен, экстракт прополиса и этиловый спирт в концентрациях, используемых в предыдущих экспериментах.

Результаты экспериментов, представленные на рис.11.3, свидетельствуют о том, что в данных условиях подтвердилась малая токсичность бензоата натрия и экстракта из листьев смородины, а также высокая токсичность экстрактов из листьев березы и прополиса. Однако, по сравнению с первым экспериментом (см.рис.11.1), произошло усиление токсичности экстракта из листьев черемухи, наряду с наблюдаемым снижением токсичности метилпарабена, а также некоторое ухудшение влияния на клетки этилового спирта.



Рисунок 11.3 Суммарное количество живых клеток по отношению к контролю (светлые столбцы) и количество мертвых (темные столбцы) при действии некоторых биоцидных добавок на клетки L292


При введении метилпарабена в питательную среду возможны осложнения, связанные с его плохой растворимостью в водных системах. Для увеличения растворимости его предварительно растворяют в небольшом количестве спирта и затем медленно, по каплям, при перемешивании вносят в питательную среду, которую потом и добавляют к ростовой питательной среде. К сожалению, в описываемых экспериментах процесс внесения метилпарабена в опытные питательные среды (концентрация спиртового раствора, интенсивность перемешивания питательной среды и скорость прибавления спиртового раствора) не был стандартизирован. Поэтому для прояснения обнаруженной аномалии требуются дополнительные осмысленные эксперименты.

Как уже отмечалось выше, для детального исследования закономерностей, связанных с определением величин эффектов последействия для разнообразных ингредиентов косметических препаратов требуется детальная стандартизация методики. Имеет также смысл адаптировать эту методику к клеточной системе ЛЭЧ. На наш взгляд, возможность ранжирования ингредиентов не только по величине токсичности, но и получение дополнительной информации, касающейся механизмов токсического действия (положительные и отрицательные эффекты последействия), позволяют рассматривать предлагаемую методику в качестве основной.

Методика фактически моделирует процесс взаимодействия ингредиентов косметических средств с клеточными системами кожи, продолжительность которого определяется часами, а не десятками часов, как это происходит при стандартном культивировании клеток в течение 72-98 часов в питательной среде, содержащей испытуемый ингредиент. Поэтому устраняется основной недостаток клеточных тест-систем - их высокая чувствительность. Действительно, если бы мы попробовали в течение 72 часов культивировать любую клеточную систему в питательной среде, содержащей 5% спиртовых экстрактов, то, в соответствии в полученными ранее данными, клетки погибли бы полностью уже при концентрации чистого этилового спирта около 1%. Таким образом, для определения относительной токсичности различных биоцидных добавок, растворенных в спирте, потребовалось бы снизить их концентрацию примерно на порядок. Снижая длительность взаимодействия биоцидной добавки до одного-трех часов и воздействуя на клетки, прикрепленные к поверхности стекла, мы приближаем условия эксперимента к реальным условиям воздействия ингредиентов косметического препарата на клеточные системы кожи.

Таким образом, несмотря на некоторую противоречивость полученных данных и необходимость детальной экспериментальной проверки выдвинутых предположений, по результатам исследований можно рекомендовать в качестве наименее токсичных биоцидных добавок экстракт смородины и бензоат натрия.

На наш взгляд, именно такого рода эксперименты (на микробных культурах и на тканевых клеточных системах) должны предшествовать выбору биоцидных добавок для косметических средств. Остается только договориться "всем миром", выбрать конкретную тест-систему (см.п.9.1.3), и стандартизировать методику оценки относительной токсичности ингредиентов косметических препаратов.

Естественно, что результаты, получаемые в результате использования клеточных культур, будут отличаться от обычно применяемой оценки безопасности консервантов на животных